Nel 2000 consegue un diploma di recitazione presso la Scuola Teatès di Palermo (direttore Michele Perriera).
Attrice e autrice teatrale, Isabella Ragonese ha scritto, diretto e interpretato diverse sue opere come Che male vi fo e Bestino.Vincitrice di concorsi per artisti emergenti, tra cui nel 1998 il primo premio del concorso nazionale INDA (Istituto Nazionale Dramma Antico) con un saggio breve sulla figura di Ecuba nella tragedia euripidea.
Il suo primo film è stato Nuovomondo di Emanuele Crialese del 2006. Dopo aver partecipato al film indipendente Detesto l'elettronica stop di Cosimo Messeri, ottiene poi il ruolo di Marta, la protagonista precaria e neolaureata in Filosofia teoretica nel film di Paolo Virzì, Tutta la vita davanti, che le vale una candidatura ai Nastri d'argento 2008 come migliore attrice protagonista. Nel luglio del 2008 è stata premiata a Parma con il trofeo "Maurizio Schiaretti", riconoscimento dedicato agli attori emergenti del cinema italiano.
Il 27 luglio 2008 al Festival Teatro e colline di Calamandrana Alta ha portato in scena un'opera da lei scritta dal titolo Mamùr e interpretata in coppia con Giuseppe Sangiorgi, riportando un notevole successo.
Nel 2008 è stata scelta come interprete per il film Viola di mare al fianco di Valeria Solarino e sotto la direzione della regista Donatella Maiorca, film tratto dal libro Minchia di Re di Giacomo Pilati. Nel 2009 ritorna sul grande schermo con i film Due vite per caso, regia di Alessandro Aronadio, Oggi sposi di Luca Lucini e Dieci inverni, regia di Valerio Mieli.
Nel 2010 interpreta Elena, la moglie di Elio Germano, nel film La nostra vita di Daniele Luchetti e vince il Nastro d'Argento alla migliore attrice non protagonista per le sue interpretazioni nel film di Luchetti e in Due vite per caso. Nello stesso anno è stata anche la madrina della 67ª Mostra internazionale d'arte cinematografica di Venezia.
Per La nostra vita riceverà la sua prima candidatura ai David di Donatello 2011 come miglior attrice protagonista. Nel 2011 recita per la prima volta in una produzione televisiva, partecipando ad un episodio della serie televisiva Il commissario Montalbano. Nel marzo 2011 ha partecipato come protagonista al videoclip di Luciano Ligabue Il meglio deve ancora venire, contenuta nell'album Arrivederci, mostro!
Sempre nel 2011 è protagonista sul grande schermo del film Il primo incarico sotto la regia di Giorgia Cecere, e de Il giorno in più con Fabio Volo.
Da gennaio a maggio 2012 ha recitato a teatro ne La commedia di Orlando per la regia di Emanuela Giordano, liberamente tratto dal romanzo Orlando di Virginia Woolf. Nel maggio 2013 recita nel dramma teatrale Taking care of baby al Teatro Eliseo di Roma.
Nel 2014 dà voce al personaggio di Griet nell'audiolibro La ragazza con l'orecchino di perla di Tracy Chevalier.
